Особенности исследования и изъятия волос для биологических и судебно-химических исследований

Павлова Альбина Захаровна доктор медицинских наук научный сотрудник, Российский центр судебно-медицинской экспертизы 101000, Россия, г. Москва, ул. Поликарпова, 12 Pavlova Al'bina Zakharovna Doctor of Medicine Researcher, Russian Center for Forensic Medical Examination 101000, Russia, Moscow, Polikarpova str., 12 himija@rc-sme.ru Калёкин Роман Анатольевич доктор фармацевтических наук научный сотрудник, Российский центр судебно-медицинской экспертизы 101000, Россия, г. Москва, ул. Поликарпова, 12 Kalekin Roman Anatol'evich Doctor of Pharmacy Researcher, Russian Center for Forensic Medical Examination 101000, Russia, Moscow, Polikarpova str., 12 himija@rc-sme.ru Орлова Алевтина Михайловна кандидат фармацевтических наук научный сотрудник, Российский центр судебно-медицинской экспертизы 101000, Россия, г. Москва, ул. Поликарпова, 12 Orlova Alevtina Mikhailovna PhD in Pharmacy Researcher, Russian Center for Forensic Medical Examination 101000, Russia, Moscow, Polikarpova str., 12 himija@rc-sme.ru Волкова Алла Андреевна кандидат фармацевтических наук научный сотрудник, Российский центр судебно-медицинской экспертизы 101000, Россия, г. Москва, ул. Поликарпова, 12 Volkova Alla Andreevna PhD in Pharmacy Researcher, Russian Center for Forensic Medical Examination 101000, Russia, Moscow, Polikarpova str., 12 himija@rc-sme.ru

Ларев Захар Васильевич старший преподаватель, Чувашский государственный университет 101000, Россия, г. Чебоксары, пр. Московский, 45 Larev Zakhar Vasil'evich Senior Lecturer, Chuvash State University 101000, Russia, Cheboksary, Moskovsky Ave., 45 himija@rc-sme.ru

Введение

Волосы являются одним из метаболически активных и информативных тканей, и по скорости обменных процессов занимают второе место после костного мозга. Одним из определяющих признаков волос является его химическая структура: они относятся к семейству гомологичных тканей эпидермального происхождения, твердым альфа-кератинам; основную часть составляет белок.

В волосе различают корень, погруженный в кожу и стержень – над поверхностью кожи. В корне, в нижней его части, так называемом матриксе, находится область активного деления клеток и роста волоса, которая окружает волосяной фолликул, через который происходит питание и иннервация волоса. В своём развитии волос проходит фазы активного роста – анаген и покоя – катаген и телоген. Активная фаза продолжается в среднем 1000 дней. В этой фазе клетки волосяного сосочка активизируются, в них увеличивается синтез ДНК и РНК, активно вырабатывается меланин в меланоцитах матрикса. К концу фазы анагена – метанагене, клетки матрицы и внутреннего корневого влагалища начинают кератинизироваться и волос вступает в фазу катагена. Эта фаза длится примерно 100 дней и, сохраняется она до появления волоса над поверхностью кожи. Отживший волос выталкивается растущим волосом – фаза телогена. Новые волосы достигают поверхности кожи на 3-ей неделе. Ежедневное удлинение волоса на голове составляет в среднем 0,37 мм/сутки, в течение месяца – 1,5–3,2 см. При насильственном отделении волос конфигурация его корня и содержание пигмента зависят от фазы роста волоса. У лиц светловолосых (русых, светлорусых, темнорусых) – блондинов, количество пигмента меньше, чем у темноволосых (черных) – брюнетов, где волос полностью заполнен пигментом черного цвета. В зависимости от фазы роста и исходного цвета волоса меняется количественное содержание пигмента в луковице и в стержне волоса.

В последнее время, в связи с развитием науки и совершенствованием технического оснащения в широкую практику вошло исследование волос с целью установления причин заболевания, назначения лечения, исследования окружающей среды; выдвинуло необходимость изучения широкого круга метаболических, трофических, психических и других заболеваний. Оказалось, что первые симптомы и признаки заболевания могут проявиться в волосах: его цвете, форме, структуре, характере роста, содержимом и составе ферментов, наследственно обусловленных факторов и других. Для выявления этих изменений изучаются, серологический, ферментный, морфологический элементный, генетический и другие составные компоненты волос. Полный состав элементов на протяжении волоса может оказаться столь же уникальным для каждого индивидуума, как и отпечатки пальцев.

В судебно-следственной практике часто на исследование с места происшествия изымаются волосы, для решения вопросов, возникших при этом, привлекаются судебные медики. В связи с особенностью строения и функции волос (они не вступают в обратную связь с организмом и как бы являются архивом обменных процессов человека) возрастает их значимость. Для своей работы судебными экспертами разработаны методики изъятия, последовательность и техника проведения исследования.

Однако для клиницистов и токсикологов, даже судебных химиков таких разработок нет. Состояние волос, изъятых при заболеваниях и отравлениях, часто изучается без соблюдения правил их изъятия, изучения морфологической структуры (длины, наличие сердцевина, заполнения токсикантом толщи волоса, указания увеличения микроскопа и других); учета стадии роста волоса, характера механических повреждений. Диагноз ставится часто на основании наличия «черного пигмента», «веретенообразной луковицы», «колбообразных вздутий». Все это приводит к неправильной трактовке результатов исследования волос

Для судебных медиков, криминалистов, антропологов волосы – объект для идентификации личности, расовой принадлежности, установления причин отравления, элементного состава и других ^[1].

Учитывая сегодняшнюю актуальность лечения биологически активными добавками в клинике, необходимо уточнить количественное значение потребности организма в отдельно взятых элементах. Известно, например, содержание часто применяемых элементов для лечения рака: селена, лития и других.

Волосы как объект исследования являются весьма интересными с точки зрения наркологии и судебной токсикологии. Анализ волос с целью определения наркотических, психотропных, сильнодействующих ядов и лекарственных средств – одна из самых динамично развивающихся областей судебной химии, как в плане разработки методических подходов к анализу, так и в плане интерпретации результатов ^[2,3]. Судебно-химический и химико-токсикологический анализ волос считается стандартным методом выявления хронического потребления алкоголя и психоактивных веществ, поскольку информация об их употреблении хранится в волосах неопределенно долгое время. Наиболее перспективным является методы хромато-масс-спектрометрия и тандемная масс-спектрометрия ^[4,5].

Не менее перспективным является исследование типов α-полипептидов кератина волос у человека и животных методом электрофоретического анализа. Было доказано, что у человека и высших приматов определяются 7 анодных α-полипептидных фракций. При исследовании волос представителей разных рас было отмечено, что у европеоидов приблизительно в 6 % случаев выявлялась атипичная фореграмма полипептидов, отличная от обычных. Анализ волос и ногтей в семьях этих индивидов, показал наследственную передачу этих признаков, как доминантных. В волосах негроидов и монголоидов этот признак обнаруживался гораздо реже. Зарубежные исследования методом изоэлектрофокусирования в кислых ПААГ показали возможность применения этого метода у человека для решения вопроса об индивидуальной принадлежности волос.

Анализ ферментов корня волос показал наличие в них фософоглюкомутазы, эритроцитарной кислой фосфатазы, эстеразы Д, фогсфоглюконатдегидрогеназы, наследуемых генетически. В луковице волос содержится ферментная система, катализирующая метаболизм канцерогена – бензопирен. Была зарегистрирована активность эпоксидгидротазы и арилуглеводородгидроксилазы.

Волосы являются биологическим материалом, в которых функциональные группы белков связываются с токсическими и психотропными веществами. Способность этих веществ растворяться в жирах является критическим фактором при определении уровня переноса из кровотока через клеточную мембрану в растущую луковицу корня. Существуют другие пути, по которым возможно поступление препарата, наблюдаемого в самих волосах. Препараты могут находиться в выделяемом потовых желёз и сальной железы, которая расположена в собственной коже. Устье сальной железы доходит до верхнего края наружного корневого влагалища и омывает волос. Потовые железы располагаются в подкожно-жировой клетчатке, устье которых выходят на поверхность кожи. Получаемые вещества с поверхности волоса представляют собой главным образом сальный секрет. Хроматографические фракции их состоят в основном из свободных жирных кислот и нейтральных жиров – сложных эфиров, глицерина, парафина и другие. Поскольку эти оба секрета омывают стержень волоса по мере его роста, это оказывает свое влияние на инородные включения, вошедшие в структуру волоса. Целесообразно эти наложения на поверхности волос смывать этанолом, который удаляет их активнее, чем бензол, эфир, хлороформ ^[6-10].

Исследование волос на элементный состав, отравляющие и психоактивные вещества с клинической точки зрения сопряжено с трудностями, как например, отсутствие понятие «нормы», особенно у детей. Кроме того, отсутствует последовательность (алгоритм) изъятия, построения методов исследования и заключения, что может привести к ошибочным выводам ^[11,12].

Актуальность

В настоящее время, несмотря на большое количество проведенных исследований судебно-медицинскими экспертами и клиницистами, не существует полной, целенаправленной программы по исследованию волос на элементный состав, психоактивные и отравляющие вещества, ферментную систему, в которой были бы озвучены методики исследования волос не только для судебно-медицинской, но и для клинической, экологической практики. Судебными медиками разработаны методы и техника проведения таких исследований. Однако для клиницистов, токсикологи таких разработок нет. Изъятие и исследование волос для изучения морфологической структуры проводится без соблюдения правил (длины, описания структуры, указания увеличения микроскопа, характеристики включений и других). Отсутствие данных в широком доступе об особенностях волос; по определению содержания внедренных в организм инородных веществ, рождает противоречивые и даже ошибочные данные. Стандартизация методов сделало бы возможным, использование, например, активацию фотонами для определения структуры волоса на всем его протяжении ^[13,15].

В нашей практике было проанализированы заболевания детей с неясной этиологией, сопровождающиеся алопецией, изменениями в нервном статусе, желудочно-кишечном тракте и других

Целью настоящего исследования явилось выработка тактики изъятия волос в качестве образцов, а также с места происшествия и, последовательность изучения структуры волос, для установления наличия повреждений, признаков отравления токсическими веществами – химическими элементами и их соединениями, психоактивными и отравляющими веществами. С этой целью мы обратились к нашему опыту работы и литературным данным.

Материалы и методы исследования

Материалом изучения явились волосы детей, с подозрением на отравление таллием, представленных нам в виде фотографий. Из описательной части морфологического исследования волос известно: «корни волос истончены; веретенообразной формы, наличие черного пигмента, волосяная сумка отсутствует. Патология»; «Пушковый волос. В основном в норме. Некоторые из них имеют истонченный корень без сумки. В единичных волосах небольшое отложение пигмента. Частичная патология (новый волос)»; «Волосы пушковые. Накопление пигмента. Патология».

Количество пациентов с подозрением на отравление таллием – 46, в возрасте от 9 месяцев до 12 лет. Представленные волосы матерей нами не изучались в виду нецелесообразности. Нами были изучены фотографии 56 волос в различной фазе роста, и стержни волос. Известно, что отравление таллием трудно диагностируются. Морфологически это проявляется включениями чёрно-багрового цвета в луковице и стержне волос в фазе роста волос – анагене. Микроструктура волос зависит и от цветности волос. Мы учли эти факторы и разделили представленные волосы на:

1) волосы в фазе анагена: с признаками отравления (веретенообразные);

2) в фазе – анагена (без признаков отравления);

3) в фазах катагена и телогена;

4) стержни волос.

Из представленных 46 образцов, нами было установлена патология у 10 пациентов по их морфологической структуре.

Вторым направлением наших исследований было изучены волос для установления в них ПАВ – прегабалина путем специальной предварительной подготовки объекта к исследованию. Были проведены экспериментальные исследования с нативными волосами путём воздействия на них токсиканта – прегабалина.

Результаты собственных исследований

Известно, что при насильственном отделении в фазе анагена, волос имеет разнообразную конфигурацию, чаще в виде крючка, и окружен влагалищными оболочками, содержит пигмент, который концентрируется в зоне матрицы. В исследованных нами 10 образцах (1-4 волоса) луковица представлена веретенообразной формы, без влагалищных оболочек, пигмент чёрного цвета, который переходит на стержень волоса. Длина луковицы превышает толщину в 3-4 раза. Такая форма луковицы присуща жизнеспособному волосу, отделённого не насильственным путём. Например, при воздействии токсиканта на клетки, соединяющие стержень волоса с влагалищными оболочками в фазе анагена. Токсикант, в частности таллий, поступая в структуру волоса, одномоментно, обычно занимает всю толщу волоса и по мере роста продвигается вверх по стержню, оставляя после себя натуральный цвет структуры волоса, что особенно видно у блондинов. При прерывистом поступлении включения чёрно-багрового цвета должны чередоваться с нормальной структурой волоса. В то же время следует отметить, что такое высокое сплошное расположение пигмента на стержне, свойственен и черному пигментированному волосу брюнетов. Цветовая гамма волоса описана как черная, тогда как таллий образует багрово-черные включения.

У 20 пациентов, исследовано 32 волоса в стадии анагена. Луковицы содержат пигмент черного цвета, количество которого не одинаковое у разных волос – от не значительного до значительного, переходящий на стержень. Этот пигмент создаёт общий фон волоса. На фотографиях волос, вероятно блондинов, фон волоса светлее, и в них просматривались отдельные образования, похожие на скопления пигмента и продольную исчерченность. Описанные образования в виде «пигмента черного цвета», являются также естественным состоянием волос. Об этом свидетельствует прерывистость скоплений пигмента в толще волоса и в корне.

Таким образом, у некоторых объектов имеются признаки сходные с воздействия токсиканта, но утверждать, что они оставлены таллием, не представляется возможным, так как черный цвет включений зависит от естественного состояния волоса, расположение включений в толще волоса не характерное для таллия.

Отживающие волосы (фаза катагена, покоя) – 11 пациентов, исследовано 14 волос. Патология обнаружена исследователями в одном волосе. Для таких волос характерна колбообразная форма луковиц с остатками влагалищных оболочек, окружающих волос в виде «венчика». Скопления пигмента не характерны для таллия. Эти образования являются скоплениями пигмента, или продольной исчерченностью. Такие волосы не несут информацию об отравлении таллием после завершения активной фазы.

Отжившие волосы в фазе телогена, покоя – 2, исследовано 2. Патология выявлена в одном случае.

В фазе покоя волосы не связаны с обменным процессом организма и токсикант не поступает в волос в этих фазах.

Патология стержня – 3, исследовано 6 волос. Патология обнаружена у одного пациента. Однако, представленные повреждения являются механического характера и не связаны с какой бы то не было интоксикацией. «Колбообразные вздутия» не свидетельствуют об отравлении, они могут образоваться вследствие механического повреждения волоса. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследования волос в разных фазах роста

Table 1. Results of hair research in different growth phases

Примечание: в числителе - количество пациентов, в знаменателе – количество обнаруженной патологии.

В последнее время появились сообщения об использовании волос токсикологами для определения психоактивных веществ, вызвавшего отравление. Так, в периферических и корневых отделах волос тандемной масс-спектрометрией был выявлен кокаин. Однако, авторы не приводят данных в какой стадии роста находились волосы и время проведения исследования. Одновременное установление токсиканта в разных отделах волосах свидетельствует о длительном, прерывистом их поступлении, или неправильном их изъятии. Использование всей длины волос при механическом их размалывании снижает чувствительность исследования. Для более точного определения наличия и количества токсикантов целесообразно в анамнезе установить хотя бы примерное начало его поступления и брать определённые участки волос. Для повышения чувствительности целесообразно обнажить внутреннюю структуру волоса, путем разрушения его целостности. Из представленных методов наиболее объективным является обнажение внутренней структуры волоса путем его раздавливания.

Экспериментальные исследования были проведены на волосах с целью доказательства наличия в них токсиканта прегабалина с соблюдением алгоритма изъятия волос и проведения подготовки пробы объектов с применением методики, не разрушающей целостность волоса. На основании нашего практического опыта и экспериментальных данных нами предложен методических подход к изъятию и исследованию волос для определения инородных включений с структуру волоса.

Анализ волос может быть дополнением к анализу более обычного биологического материала при вскрытии трупа – крови, мочи, желчи и внутренних органов, при отравлении солями тяжелых металлов, исследовании причин смерти от передозировки, хронического употребления наркотиков.

Забор образцов волос проводится в соответствии с приказами, регламентирующими правила забора биологического материала на исследование: Минздравсоцразвития РФ от 12.05.2010, №346н «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» (Зарегистрировано в Минюсте РФ 10.08.2010 №18111), Минздрава России от 18.12.2015 №933н (ред. от 25.03.2019) «О порядке проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического)» (Зарегистрировано в Минюсте России 11.03.2016 №41390) и Минздравсоцразвития РФ от 27.01.2006 №40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ».

Волосы отбираются из разных участков тела человека - волосы с головы (лобная, височные, затылочная, теменная области) для сравнительного исследования – при убийствах или подозрении на них, транспортных происшествиях и других. Целесообразно брать волосы из подмышечных впадин. Там волосы более чистые. Волосы для проведения токсикологического исследования изымают вместе с луковицами и влагалищными оболочками, высушивают и помещают в отдельные бумажные конверты, или специальные пластиковые пакеты, которые маркируют, заклеивают и опечатывают печатью соответствующего подразделения. Волосы следует брать учитывая время начала интоксикации и скорость роста волос.

Сбор посмертных образцов волос включает в себя: высушивание; деконтамацию с целью удаления поверхностных загрязнений. Промывку можно проводить по любой методике, принятой в конкретной лаборатории. Необходимо контролировать смывы.

В настоящее время для обнаружения и количественного определения при проведении элементного анализа используется метод атомно-абсорбционной спектроскопии высокого разрешения с электротермической атомизацией с использованием приставки дозатора для исследования жидких проб. При применении атомно-абсорбционных и эмиссионно-абсорбционных методов следует применять соответствующую методику. Проба подготовка на элементный состав: 100 мг волос заливается 3 мл концентрированной азотной кислоты, 2 мл перекиси водорода. Смесь запускают в микроволновую систему и запускают программу разложения.

При подозрении на отравление наркотическими средствами, психотропными веществами и лекарственными препаратами берут волосы весом не менее 300 мг, навеска делится на две равные части: рабочий и контрольный образцы. На исследование необходимо брать навеску не менее 100 мг.

Этапы анализа образца происходят без участия оператора под управлением программного обеспечения ААС contr AA 700. Калибровка содержания элементов проводится по водным стандартам (рисунок 1.).

Рисунок 1. Калибровочный график таллия

Figure 1. Waist calibration graph

После установления количественного определения элементов в биологическом объекте необходимо соотнести это количество к токсическим или смертельным дозам. Для этих целей рекомендуется пользоваться представленными в списке литературы научно-практическими источниками.

Рекомендуется при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследования образцов волос и интерпретации результатов исследования учитывать следующие особенности: чем выше липофильность токсиканта и больше период его полувыведения из организма, тем в большей степени вещество накапливается в структуре волоса. Амфотерные, высоко гидрофильные вещества накапливаются в малых количествах.

Степень накопления токсических веществ в волосах зависит от их кислотно-основных свойств и наличия пигмента (эумеланина и феомеланина). Вещества кислой природы равномерно распределяются, как в пигментированных, так и в непигментированных волосах, а вещества основной природы преимущественно в волосах с высоким содержанием меланина (рыжих, светлых, черных, русых).

Волосы с преимущественным содержанием феомеланина (природные рыжих, блондины) сложнее подвергаются всем видам гидролиза, поэтому возможно получение заниженных результатов при количественной оценке токсиканта.

Процедура окрашивания не приводит к увеличению матричного эффекта и не оказывает влияния на возможность проведения идентификации и количественной оценки токсических веществ.

Рекомендуется для проведения ретроспективного и сегментационного анализа волос использовать пробоподготовку ферментативным гидролизом протеазами. Установлена возможность ретроспективного (по результатам исследования через 24 недели после последнего приема) обнаружения токсикантов со свойствами слабых кислот и высоким показателем периода полувыведения из организма в количествах, сопоставимых с их количеством при регулярном приеме (пример фенобарбитала). Такие токсиканты накапливаются преимущественно в прикорневом сегменте, то есть по мере роста волоса.

Ретроспективное обнаружение лекарственных веществ основного характера и низким показателем периода полувыведения из организма возможно через 6 недель после последнего приема, результаты количественной оценки могут быть ниже, чем при регулярном приеме (например, на наличие дифенгидрамина гидрохлорида, тропикамида, производных гамма-аминомасляной кислоты). Токсиканты с данными свойствами в большей степени накапливаются в концевом сегменте, то есть за тот короткий промежуток времени, пока он циркулировал в крови (плазме крови).

Определена невозможность обнаружения в волосах токсикантов с коротким периодом полувыведения и высокогидрофильных при их однократном приеме.

Определение веществ в образцах волос от трупов и живых лиц может считаться признаком систематического (хронического) употребления данных соединений. Длина пряди волос 1,5-2 см соответствует примерно одномесячному промежутку времени.

Алгоритм морфологического исследования волос на элементы:

Изъятие волос. Волосы для морфологического исследования изымаются с пяти областей головы не менее 20 волос. В случаях выпадения (алопеции) следует собрать свободно лежащие волосы. По краю сохранившихся волос, не прилагая большого усилия, как бы поглаживая, собрать выпавшие волосы, а также выдернуть несколько волосков с силой. Отметить длину волос и время изъятия. Для контроля следует изъять волосы с неповрежденной части головы, сложить всё в отдельные пакеты. Пакеты следует надписать и опечатать.

Макроскопическое исследование. Предварительным осмотром следует установить макроскопическую цветность волос в пучке, то есть на голове, а также отдельных волос. В пучке волосы обозначаются как белокурые, светло-русые, русые, темно- русые, черные, рыжие, седые. Отдельные волосы обозначаются как желтый, белый, коричневый, черный, серый. По следственным данным установить примерное время поступления токсиканта.

Микроскопическое исследование. Исследовать следует не менее 15-20 волос из очага алопеции, и описать структуру и особенности каждого волоса по схеме, которая применяется судебно-медицинскими экспертами отдела исследования вещественных доказательств. Для таллия характерным является компактные скопления багрово-черного цвета в структуре волоса, располагающегося по всей толще волоса. При одномоментном поступлении он может располагаться в луковице или на стержне, в зависимости от давности отравления. При хроническом включении в виде непрерывного тяжа на протяжении луковицы и стержня.

Заключение

В представленных на исследование микрофотографий волос с подозрением на отравление детей таллием признаков, свидетельствующих о воздействии таллия не установлено. Об этом свидетельствует отсутствие о наличии включений багрово-чёрного цвета в описании волос. Кроме того, из представленной специалистами информации, спектральным анализом ведущих лабораторий таллий не был обнаружен.

Описанные повреждения в виде включений «чёрного цвета», «колбообразных образований» и «утолщений сердцевины» характерны для нормальных волос и не являются признаками воздействия какого бы то ни было токсиканта.

Морфологическая форма некоторых волос свидетельствует о воздействии на волосы токсического агента, который воздействовал на их структуру вследствие которого произошло их выпадение (алопеция). Вероятно, повреждающий фактор действовал на десмосомы кутикулы стержня и влагалищные оболочки волос, и он как бы вылущился из собственного ложа волос. Форма таких волос веретенообразная. Такими агентами могут быть элементы с переменной валентностью, как например, бор, гафний, индий, стронций, а также гидразин- фторсодержащие химические вещества и других

Волосы несут на себе информацию о поступлении в организм интоксиканта в фазе активного роста – анагене. Наличие таких образований в фазе телогена свидетельствует о поступлении токсиканта в прошлом, примерно три месяца назад. Фаза катагена информацию не несет. Учитывая фазу роста волос и время начала поступления токсиканта, можно более точно определить место обнаружения его на волосе. Это важно при применении точечного спектрального исследования.